一、原理 本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的蘇丹紅和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)蘇丹紅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物蘇丹紅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)蘇丹紅的含量。 ? 二、試劑盒技術(shù)指標(biāo) 試劑盒靈敏度：???????? 0.4ppb 樣本定量檢測(cè)下限 水基質(zhì)（番茄醬、壇壇鄉(xiāng)）?? 0.4ppb 油基質(zhì)（辣椒油，辣椒醬） ? 0.4ppb 粉末狀（辣椒粉）????????  1.0ppb 交叉反應(yīng)率 蘇丹1號(hào) ……………………………………………… 100％ 蘇丹2號(hào) ……………………………………………… ＜1％ 蘇丹4號(hào) ……………………………………………… ＜1％ 對(duì)位紅 ………………………………………………… 120％ 樣本回收率 水基質(zhì) ……………………………………………… 75±10％ 油基質(zhì) ……………………………………………… 50±10％ 粉末狀 ……………………………………………… 65±10％ ? 三、?試劑盒組成 1、微量測(cè)試孔：96T 2、 標(biāo)準(zhǔn)品液：（1ml/瓶） 0ppb、0.4ppb、3.2ppb、6.4ppb、12.8ppb、25.6ppb 3、 酶標(biāo)記物?? ?????? 12ml 4、 抗體工作液??????? 7ml 5、 底物緩沖液破????? 7ml 6、 底物液??????????? 7ml 7、 終止液??????????? 7ml 8、 20倍濃縮洗滌液?? 50ml 9、1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品液：（0.2ml） ? 四、樣本處理 取1g樣品（辣椒面、辣椒油、辣椒醬、番茄醬），加入3 mL**溶液，超聲震蕩20 min，渦旋混合0.5 min，靜置10 min， 3000 r/min離心分離10 min，取上清100 μL用PBST稀釋10倍至1 mL，取50 μL進(jìn)行ELISA測(cè)定。 ? 五、操作步驟 1. 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～26℃）下平衡30min以上，將需用的條板固定于支架，按順序編號(hào)； 2. 洗液配制：將50 mL濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至1000 mL備用。（或按需量稀釋） 3. 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：先將試劑盒中的1 mg/mL蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品用洗液稀釋1000倍，變成1000ng/mL，再用洗液將1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成0.4 ng/mL， 3.2 ng/mL，6.4 ng/mL，12.8 ng/mL，25.6 ng/mL。（現(xiàn)配現(xiàn)用） 4. 在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50 μL待測(cè)樣品，然后每孔加入50 μL抗體（加入標(biāo)品和樣品時(shí)無(wú)時(shí)間差的影響），輕拍混勻，37℃下孵育30min； 5. 倒出孔中的液體，以試劑盒濃縮洗液稀釋20倍后作為洗液，用洗板機(jī)洗滌4～6遍；沒(méi)有洗板機(jī)的用戶可用300 μL洗液充入各孔中，靜置20 s，倒出孔中的液體，將微孔架倒置，在吸水紙上連續(xù)拍打3次以上，以保證完全除去孔中的液體，重復(fù)操作4～6遍； 6. 每孔加入酶標(biāo)記物100 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃ 環(huán)境中反應(yīng)20 min ，取出重復(fù)洗板步驟。 7. 顯色：每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL．輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，置37℃ 環(huán)境中反應(yīng)10 min。 8. 測(cè)定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻．設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630 nm 檢測(cè)，在20 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。 ? 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制方法： （1）準(zhǔn)備5個(gè)1 mL瓶子，其中一個(gè)加入1000 μL洗液，一個(gè)加入700 μL洗液，其余的分別加入500 μL洗液。 （2）在1000 μL洗液瓶子中先吸出25.6 μL的洗液，然后加入25.6 μL的1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，使其濃度為25.6 ng/mL，作好記號(hào)； （3）再?gòu)?5.6 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一個(gè)500 μL洗液的瓶子中，使其濃度為12.8 ng/mL，混勻，作好記號(hào)； （4）再?gòu)?2.8 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一個(gè)500 μL洗液的瓶子中，使其濃度為6.4 ng/mL，混勻，作好記號(hào)； （5）再?gòu)?.4 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一個(gè)500 μL洗液的瓶子中，使其濃度為3.2 ng/mL，混勻，作好記號(hào)； （6）再?gòu)?.2 ng/mL的瓶子中吸出100 μL加入其中一個(gè)700 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.4 ng/mL，混勻，作好記號(hào)。 （加樣前應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品充分混勻，配好后在半小時(shí)內(nèi)使用） ? 七、?結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中蘇丹紅實(shí)際濃度。 ? 八、?注意事項(xiàng) 1．室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。 2．洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4．反應(yīng)終止液為2M**，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6．不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。 7．顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之，0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。 8．該試劑盒比較好反應(yīng)溫度為25 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。 ? 九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。